IL-10 and IL-17 contents in culture supernatants of γδ T lymphocytes expanded from blood of patients with reactive erythema

Full Text

Введение

Реактивные эритемы представляют собой группу заболеваний со сложным малоизученным иммунопатогенезом, для которых отсутствуют как специфические биологические маркеры, так и этиопатогенетическая терапия. Реактивные эритемы характеризуются общими патогенетическими механизмами, в цепочке которых лежат дисфункции иммунного ответа, и эти дисфункции ассоциированы, поддерживаются или индуцируются триггерными факторами различной природы. Публикации, посвященные роли иммунных клеток в патогенезе реактивных эритем и их функциональной активности, единичны.

Известно, что в развитии аутоиммунных и воспалительных заболеваний принимают участие субпопуляции гамма-дельта (γδ) Т-клеток, способствуя повреждению тканей. Воспалительные функции γδ Т-клеток определяются синтезом ими цитокинов, включая IL-17, IFNγ и TNFα, которые обычно вовлечены в аутоиммунитет. Повышенная и нерегулируемая активность γδ Т-клеток может способствовать или вызывать аутоиммунные заболевания и аутовоспалительные процессы с поражением кожи, включая псориаз, склеродермию, красную волчанку.

Благодаря уникальным свойствам γδ Т-клеток, сочетающим адаптивные и врожденные иммунные функции, более глубокое понимание этой популяции Т-клеток позволит пролить новый свет на патогенез аутовоспалительных заболеваний, в том числе реактивных эритем, и позволит разработать новые терапевтические подходы.

γδ Т-клетки – субпопуляция Т-лимфоцитов, которые экспрессируют γ- и δ-цепи Т-клеточного рецептора и демонстрируют структурную и функциональную неоднородность. γδ Т-клетки присутствуют в организме обычно в небольшом количестве и составляют 1-5% лимфоцитов крови и периферических лимфоидных тканей. Являясь связующим звеном между врожденным и адаптивным иммунитетом, γδ Т-клетки способны быстро реагировать на стимуляцию и регулировать иммунные реакции в периферических тканях.

Выработка цитокинов и факторов роста αβ-клетками и γδ Т-клетками помогает поддерживать гомеостаз кожи. Повышенная и неконтролируемая активность Т-клеток может способствовать развитию или вызывать хронические воспалительные заболевания.

Интерлейкин-17A (IL-17A) – это провоспалительный цитокин, ген которого впервые был клонирован в 1993 году [8, 15]. IL-17 выполняет множество физиологических функций, в том числе: привлечение нейтрофилов, стимуляцию Th2 для обеспечения эффективного ответа на воздействие внеклеточных организмов, выработку макрофагами IL-1β и TNFα, а также индукцию матриксных металлопротеиназ (MMP) – медиаторов воспаления. Несмотря на важную роль цитокина IL-17 в регулировании адаптивного и врожденного звеньев иммунной систем, его избыточная выработка может быть связана с некоторыми заболеваниями.

В последние годы в различных исследованиях предпринимались попытки связать сигнальный путь IL-17 с развитием распространенных воспалительных заболеваний, таких как астма, хроническая обструктивная болезнь легких, волчанка, ревматическая полимиалгия, гигантоклеточный артериит, болезнь Бехчета, синдром сухого глаза, синдром Шегрена, болезнь Крона и рассеянный склероз. Было установлено, что секретирующие этот цитокин Th17-лимфоциты вовлечены в патогенез некоторых аутоиммунных заболеваний человека. Кроме того, в недавнем исследовании сообщалось о корреляции между уровнями IL-17 в сыворотке крови и активностью заболевания при аутоиммунных буллезных дерматозах, таких как герпетиформный дерматит, буллезный пемфигоид и вульгарная пузырчатка [1].

Выработка IL-17 в основном осуществляется Т-хелперами 17-го типа (Th17), CD8⁺ Т-клетками, γδ Т-клетками, инвариантными естественными Т-киллерами (iNKT), естественными киллерами (NK), естественными Th17-клетками и клетками-индукторами лимфоидной ткани (LTi). IL-17A и IL-17F, которые часто экспрессируются совместно, могут секретироваться не только клетками Th17, но и CD8-T-клетками (Tc17) [4], а также iNK [12], γδ T-клетками [3, 6] и врожденными лимфоидными клетками 3-го типа (ILC3) [10]. Существуют также противоречивые данные о способности миелоидных клеток экспрессировать цитокины семейства IL-17 [9]. Напротив, IL-17C, который играет ключевую роль в воспалении кожи, продуцируется в основном эпителиальными клетками и кератиноцитами в ответ на активацию [7]. В то же время IL-17E (IL- 25), который является наиболее вариабельным из семейства IL-17, вырабатывается кератиноцитами, но также может секретироваться эндотелиальными клетками, Т-клетками, макрофагами, миелоидными клетками и ILC. IL-17E наиболее известен своей ролью в стимулировании реакций Th2 и аллергии [13], хотя он также участвует в воспалении при псориазе [14].

IL-10 – ключевой противовоспалительный цитокин, оказывающий плейотропное воздействие на несколько типов клеток. Основная функция IL-10 – ограничивать чрезмерную реакцию Т-клеток на микробные патогены, чтобы предотвратить хроническое воспаление и повреждение тканей. IL-10 играет важную роль в контроле врожденных иммунных реакций, подавляя функцию моноцитов/макрофагов путем снижения выработки ими провоспалительных цитокинов.

Целью явилось определение содержания IL- 10 и IL-17 в супернатантах клеточных культур при экспансии γδ Т-лимфоцитов, выделенных из крови больных реактивными эритемами.

Материалы и методы

Мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) были выделены от 8 пациентов с реактивными эритемами (5 пациентов с многоформной экссудативной эритемой (МЭЭ), 1 пациент с кольцевидной центробежной эритемой (КЦЭ) и 2 пациента с мигрирующей эритемой (МЭ) – ранней формой болезни Лайма) и двух здоровых доноров в возрасте от 23 до 70 лет. Кровь получали у пациентов с их информированного согласия в пробирки типа Vacutainer с натрий-гепарином в объеме 9-18 мл. Из крови доноров получали фракцию мононуклеарных лейкоцитов, разделяя методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина по Bøyum A. [2].

Для культивирования γδ T-лимфоцитов использовали метод van Acker H.H. и соавт. [11] и Khan M.W.A. и соавт. [5].

Мононуклеарные клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10%-ной аутологичной сыворотки и золедроната (3 мкМ, или 0,8 мкг/мл) в конечной концентрации 3 млн клеток/ мл и культивировали 3 дня в СО₂-инкубаторе при 37 °С. На 4-й день культивирования среду заменяли (центрифугируя суспензию клеток и удаляя супернатант) на свежую RPMI-1640 с добавлением IL-2 (100 МЕ/мл) и IL-15 (10 нг/мл). Через 3-4 дня культивирования среду заменяли на свежую RPMI-1640, разделяя образец клеток на две пробы – с добавлением 5 мкг/мл ФГА (фитогемагглютинин) и без него, доводили концентрацию клеток до 1 млн клеток/мл и инкубировали 48 часов, а также отбирали пробы клеток для проточной цитометрии. По окончании инкубации суспензию клеток центрифугировали при 1000 об/мин 10 минут, супернатанты замораживали при минус 80 °С, а осадок клеток использовали для анализа методом проточной цитометрии к клеточным маркерам CD3, CD4, CD8, γδ TCR, HLA-DR, CD14 и CD86 (Beckman Coulter, США). Для этого клетки ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере с концентрацией 1 млн/мл и окрашивали флуоресцентно-мечеными моноклональными антителами для проточной цитометрии. Для этого к 50 мкл суспензии клеток добавляли 5 мкл антител, инкубировали 20 минут в темноте и отмывали фосфатно-солевым буфером (центрифугируя при 300 g и удаляя супернатант). Далее суспензию окрашенных клеток ресуспендировали в 400 мкл фосфатно-солевого буфера и анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США).

Спонтанную и индуцированную секрецию цитокинов определяли методом твердофазного ИФА с использованием наборов Human IL-17 ELISA Kit (RK00397, ABclonal Biotechnology Co., Китай) и «Интерлейкин-10-ИФА-БЕСТ» (АО «Вектор-Бест», Россия) согласно инструкциям производителей. Обработку данных осуществляли с построением калибровочных кривых путем применения онлайн-калькулятора ELISA calculation sheet (Hycult Biotech, США).

Результаты

В группе пациентов с МЭЭ при культивировании МНПК в течение 7 дней для селективной стимуляции γδТ-лимфоцитов по описанной выше методике были выявлены представленные ниже показатели содержания субпопуляций лимфоцитов (табл. 1). У этих же пациентов были изучены концентрации цитокинов IL-17 и IL-10 в супернатантах клеточных культур методом ИФА (табл. 2).

 

ТАБЛИЦА 1. Содержание субпопуляций лимфоцитов при культивировании мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) пациентов с МЭЭ с целью экспансии γδ-лимфоцитов (результаты расширения популяции γδ Т-клеток с помощью золедроновой кислоты в 7-дневной культуре)

TABLE 1. The content of lymphocyte subpopulations in the culture of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in patients with MEE for the expansion of γδ lymphocytes (the results of the expansion of the population of γδ T cells using zoledronic acid in a 7-day culture)

Образец Sample	Субпопуляции лимфоцитов, % Subpopulations of lymphocytes, %
	СD3+	CD3+CD4+	CD3+CD8+	HLA-DR+CD3+	CD16+	CD14+	CD86+	γδTCR
1 (С)	88,3	24,9	17,9	60	1,1	1,3	64	39,8
2 (Н)	81,1	10,9	11,9	64,4	10,5	5,2	39	62,8
3 (С)	57,1	13,7	20,4	46,8	8,7	4,4	26,1	23,6
4 (С)	50,3	5	19,8	40,6	15,1	2,8	65,1	3,1

 

ТАБЛИЦА 2. Результаты определения уровней IL-10 и IL-17 в супернатантах 7-дневных клеточных культур, полученных при экспансии γδ-лимфоцитов (в результате расширения популяции γδ Т-клеток с помощью золедроновой кислоты) от пациентов с МЭЭ

TABLE 2. Results of determining the levels of IL-10 and IL-17 in the supernatants of 7-day cell cultures obtained from the expansion of γδ lymphocytes (as a result of the expansion of the γδ T cell population using zoledronic acid) from patients with MEE

Образец Sample	Продукция цитокинов, пкг/мл (1 млн клеток) Cytokine production, pg/mL (1 million cells)
	IL-17		IL-10
	спонтанная spontaneous	индуцированная induced	спонтанная spontaneous	индуцированная induced
1 (С)	60,0	139,42	61,4	236,3
2 (Н)	36,0	188,2	6,0	12,0
3 (С)	30,0	220,79	16,8	130,87
4 (С)	48,0	75,0	29,82	8,7
5 (К)	59,0	236,0	0,6	4,32

 

У пациентки 1 (С) в период рецидива клеточный состав культуры на 7-й день культивирования был представлен большей частью лимфоцитами с экспрессией СD3 (88,3%), CD3⁺CD4⁺ (24,9%), CD3⁺CD8⁺ (17,9%), отмечалось также высокое содержание клеток, несущих рецептор HLA-DR (60%), клеток с экспрессией костимулирующей молекулы СD86, (64%). В ходе культивирования МНПК количество γδ TCR⁺ клеток выросло с 4,2 до 39,8% (табл. 1).

В образце 1 (С) общее количество клеток CD4⁺, CD8⁺ и γδ TCR⁺ составляет 82,6%; следовательно, эти клетки составляют большую часть Т-клеток. В этом же образце большинство клеток экспрессируют CD86⁺ (64%).

В супернатантах полученных клеточных культур образца 1 (С) концентрация IL-17 составила при индукции ФГА 139,42 пкг/мл, спонтанная продукция составила 60,0 пкг/мл; индуцированная ФГА продукция IL- 10 составила 236,3 пкг/ мл, а при спонтанной продукции – 61,4 пкг/ мл (табл. 2).

У пациентки 2 (Н) к 7-му дню культивирования МНПК в ростовой среде с индукторами созревания было выявлено, что 81,1% клеток экспрессировали рецептор СD3, 10,9% клеток относились к CD3⁺СD4⁺ субпопуляции и 11,9% клеток супрессорной/цитотоксической субпопуляции с фенотипом CD3⁺CD8⁺, относящихся к супрессорной/цитотоксической субпопуляции; довольно высоким было содержание зрелых активированных Т-клеток HLA-DR⁺CD3⁺ 64,4%. Содержание клеток с мембранным рецептором CD16, характерным для NK-лимфоцитов и клеток миелоидного происхождения было невысоким и составляло 10,5%. Исходное содержание клеток с экспрессией γδ TCR составляло 6,4%. К 7-му дню культивирования МНПК в среде с добавлением цитокинов и золедроната накапливалось до 62,8% Т-клеток γδ TCR⁺ (табл. 1). В образце 2 (Н) большинство МНПК представлено субпопуляцией CD4⁺, CD8⁺, γδ TCR⁺Т-клеток.

Оценивали также продукцию двух цитокинов в супернатантах культур МНПК. Спонтанная продукция провоспалительного цитокина IL-17 в образце 2 (Н) характеризовалась низкими значениями – 36 пкг/мл, но под воздействием индуктора – ФГА – она увеличилась до 188,2 пкг/мл (в 5,2 раза). Содержание цитокина, обладающего противовоспалительным потенциалом – IL-10 в супернатантах было незначительным – 6 пкг/мл, при добавлении в среду ФГА наблюдался 2-кратный рост концентрации IL-10 (табл. 2).

У пациентки 3 (С) содержание составляло CD3⁺Т-клеток 57,1%, при этом соотношение Т-хелперы / Т-цитотоксические лимфоциты (0,67) было сдвинуто в сторону преобладания Т-цитоксических: CD3⁺CD4⁺ – 13,7%; СD3⁺CD8⁺ – 20,4%. Доля активированных Т-клеток CD3⁺ HLA-DR⁺ составила 46,8%, γδ TCR⁺ – 23,6%, CD86⁺Т-клеток – 26,8%. При этом исходное содержание клеток с экспрессией γδ TCR составляло 5,3% (табл. 1). Общее содержание лимфоцитов с фенотипом CD4⁺/CD8⁺/γδ TCR⁺ было примерно равно числу CD3⁺Т-клеток. Спонтанная продукция провоспалительного цитокина IL-17 была на низком уровне – 30 пкг/мл, но в присутствии ФГА протекала очень интенсивно и увеличивалась до 220,79 пкг/ мл (усиление в 7,3 раз). Ограничивающий воспалительные процессы IL-10 тоже синтезировался в небольших количествах (спонтанная продукция IL-10 – 16,8 пкг/мл), при этом индуцированная продукция повышалась до 130,87 пкг/мл) (табл. 2).

У пациента 4 (С) было обнаружено меньшее количество СD3⁺Т-клеток с фенотипом по сравнению с другими изученными пациентами – 50,3%. Содержание СD3⁺CD8⁺Т-клеток (19,8%) было приблизительно в 4 раза больше, чем в субпопуляции Т-хелперов (5,0%). Активированные СD3⁺HLA-DR⁺Т-клетки составляли 40,6%. Исходное содержание γδ TCR⁺Т-клеток было 5,1%. У данного пациента не наблюдалось увеличения субпопуляции γδ TCR⁺Т-клеток, и их доля в процессе культивирования снизилась до 3,1%. (табл. 1).

В образце 4 (С) общее содержание субпопуляций CD4⁺, CD8⁺, γδ TCR⁺Т-клеток значительно меньше (примерно в 2 раза) CD3⁺Т-клеток, не экспрессирующих указанные маркеры. Процент CD86⁺ клеток выше доли CD3⁺ и CD14⁺ клеток.

И спонтанная, и индуцированная ФГА продукция провоспалительного цитокина IL-17 была на среднем уровне – 48 пкг/мл и 75 пкг/мл. Спонтанная продукция противоспалительного IL-10 составила 29,82 пкг/мл, но при индукции ФГА этот показатель парадоксально снизился до 8,7, что значительно меньше, чем у здоровых доноров (табл. 2, 6).

У пациента 5 (К) в культуре МНПК было выявлено 72,8% CD3⁺ клеток. У данного пациента субпопуляция CD3⁺CD4⁺ составила 31,5%, СD3⁺CD8⁺ – 24,5%, HLADR⁺CD3⁺ – 37,1%. Процент γδTCR⁺ клеток составил 16,2%. Исходное содержание клеток с экспрессией γδ TCR составляло 5,2% (табл. 1). Доля CD86⁺Т-клеток составила 77,9%, СD38⁺Т-клеток – 93%.

Спонтанная и индуцированная продукция провоспалительного цитокина IL-17 протекала достаточно интенсивно – 59,0 пкг/мл и 236,6 пкг/ мл соответственно. Однако ограничивающий воспалительные процессы IL-10 синтезировался в минимальных количествах, значительно меньше, чем у здоровых доноров (спонтанная продукция IL-10 – 0,6 пкг/мл, индуцированная – 4,32 пкг/мл) (табл. 2).

В образцах крови у пациентки 6 (Р) было выявлено наличие 55,3% клеток с фенотипом CD3⁺, среди этих Т-лимфоцитов преобладала субпопуляция с фенотипом CD3⁺CD4⁺, характерным для Т-хелперов (44%), Т-цитотоксических клеток было в 2,8 раза меньше (15,7%). Доля активированных клеток, несущих рецептор HLADR, составила 40,7%, γδ TCR⁺Т-клеток – 3,6% (исходное содержание клеток с экспрессией γδ TCR составляло 1,2%) (табл. 3).

 

ТАБЛИЦА 3. Содержание субпопуляций лимфоцитов при культивировании PBMC пациентов с МЭ и КЦЭ с целью экспансии γδ-лимфоцитов (Результаты расширения популяции γδ Т-клеток при индукции золедроновой кислотой в 7-дневной культуре)

TABLE 3. The content of lymphocyte subpopulations in the culture of PBMC in patients with ME and CCE for the expansion of γδ lymphocytes (Results of the expansion of the population of γδ T cells during induction with choledronic acid in a 7-day culture)

Образец Sample	Субпопуляции лимфоцитов, % Subpopulations of lymphocytes, %
	СD3	CD3+CD4+	CD3+CD8+	HLA-DR	CD16+	CD14+	CD86+	γδTCR
6 (Р-ЭКЦ) 6 (R-ECC)	55,3	44	15,7	40,7	10,4	1,4	8,1	3,6
7 (С)	52	13,9	14	38,5	18,5	8,7	23	26,8
8 (Д) 8 (D)	88,2	7,3	33,2	84,3	6,3	3,3	74,4	44,5

 

Спонтанная продукция провоспалительного IL-17 составила 48,0 пкг/мл, при индукции ФГА отмечалось повышение – до 151,69 пкг/мл. В то же время ограничивающий воспалительные процессы IL-10 синтезировался в минимальных количествах (спонтанная продукция IL-10 – 1,54 пкг/мл), однако при воздействии ФГА значения повышались в 63 раза (до 98,76 пкг/мл) (табл. 4).

 

ТАБЛИЦА 4. Результаты определения уровней IL-10 и IL-17 в супернатантах 7-дневных клеточных культур, полученных при экспансии γδ-лимфоцитов (в результате расширения популяции γδ Т-клеток при индукции золедроновой кислотой) от пациентов с МЭ и КЦЭ

TABLE 4. Results of determining the levels of IL-10 and IL-17 in the supernatants of 7-day cell cultures obtained by the expansion of γδ lymphocytes (as a result of the expansion of the population of γδ T cells upon induction with zoledronic acid) from patients with ME and CCE

Образец Sample	Продукция цитокинов, мкг/мл (1 млн клеток) Cytokine production, mcg/mL (1 million cells)
	IL-17		IL-10
	спонтанная spontaneous	индуцированная induced	спонтанная spontaneous	индуцированная induced
6 (Р-ЭКЦ) 6 (R-ECC)	48,0	51,69	1,54	98,76
7 (С)	36,0	175,0	0,72	38,37
8 (Д) 8 (D)	37,5	246,4	0,15	0,45

 

У пациентки 7 (С) на 7-й день культивирования МНПК методом проточной цитофлюориметрии было обнаружено 52% CD3⁺Т-клеток, 13,9% CD3⁺CD4⁺ клеток, 14% CD3⁺CD8⁺ клеток, 38,5% СD3⁺HLA-DR⁺Т-клеток. В процессе культивирования было получено не менее 26,8% γδ TCR⁺ клеток. Исходное содержание клеток с экспрессией γδ TCR составляло 2,4%. Параллельно в клеточной суспензии были выявлены клетки, несущие рецепторы CD14⁺ клеток (8,7%) и CD86⁺ клеток (23%). Относительно высоким было содержание клеток CD16⁺ – 18,5% (табл. 3).

Спонтанная продукция провоспалительного IL-17 была умеренной (36,0 пкг/мл), при индукции ФГА отмечалось усиление продукции до 175,0 пкг/мл. Противовоспалительный цитокин IL-10 синтезировался в минимальных количествах (спонтанная продукция составила 0,72 пкг/ мл), однако при индукции значения повышались в 45 раз (до 38,37 пкг/мл) (табл. 4).

В образцах крови у пациентки 8 (Д) при анализе клеток, полученных после 7 дней инкубации, выявлено 88,2% CD3⁺ клеток, CD3⁺CD8⁺ – 33,2%. СD3⁺HLA-DR⁺Т-клетки составляли 84,3%. К окончанию культивирования в клеточной суспензии не менее 44,5% клеток относились к γδ TCR⁺ клеткам. Исходное содержание клеток с экспрессией γδ TCR составляло 6,2% (табл. 3).

У пациентки 8 (Д) спонтанная продукция провоспалительного IL-17 была на среднем уровне – 37,5 пкг/мл, индуцированная продукция составила 246,4 пкг/мл (увеличение в 6,6 раз). Ограничивающий воспалительные процессы IL- 10 синтезировался в минимальных количествах, значительно меньше, чем у здоровых доноров (спонтанная продукция IL-10 – 0,15 пкг/мл, индуцированная – 0,45 пкг/мл) (табл. 4).

Из образца крови здорового донора 9 (Б) по окончанию культивирования МНПК было обнаружено 58,6% CD3⁺Т-клеток, 37,3% CD3⁺CD4⁺ клеток, 21,3% CD3⁺CD8⁺ клеток, 28,5% активированных Т-клеток HLA-DR⁺CD3⁺. За время культивирования в клеточной суспензии накопилось не менее 24,1% γδ TCR⁺ клеток. Исходное содержание клеток с экспрессией γδ TCR составляло 1,7%. Процент клеток, экспрессирующих CD86, cоставил 25,9% (табл. 5).

 

ТАБЛИЦА 5. Содержание субпопуляций лимфоцитов при культивировании PBMC здоровых доноров с целью экспансии γδ-лимфоцитов (Результаты расширения популяции γδ Т-клеток при индукции золедроновой кислотой в 7-дневной культуре)

TABLE 5. The content of lymphocyte subpopulations in the cultivation of PBMC from healthy donors for the expansion of γδ lymphocytes (Results of the expansion of the population of γδ T cells upon induction with zoledronic acid in a 7-day culture)

Образец Sample	СD3	CD3+CD4+	CD3+CD8+	HLA-DR	HLA-DR+CD3+	CD16+	CD14+	CD86	γδ TCR
9 (Б) 9 (B)	58,6	37,3	21,3	31,6	28,5	1,6	3,1	25,9	24,1
10 (А)	68,8	43,7	25,1	37,7	30,4	6,5	7,2	31,6	16,2

 

В супернатантах, полученных к 7-му дню культивирования клеточных культур концентрация IL-17 составила 21,72 пкг/мл, индуцированная ФГА продукция повысилась в 7,7 раза (163,8 пкг/ мл), спонтанная продукция IL-10 составила 6,62 пкг/мл, индуцированная – повысилась в 10,6 раза (70,4 пкг/мл) (табл. 6).

 

ТАБЛИЦА 6. Результаты определения уровней IL-10 и IL-17 в супернатантах 7-дневных клеточных культур, полученных при экспансии γδ-лимфоцитов (в результате расширения популяции γδ Т-клеток при индукции золедроновой кислотой) от здоровых доноров

TABLE 6. The results of determining the levels of IL-10 and IL-17 in the supernatants of 7-day cell cultures obtained by the expansion of γδ lymphocytes (as a result of the expansion of the population of γδ T cells during induction with zoledronic acid) from healthy donors

Образец Sample	Концентрация цитокинов, пкг/мл (1 млн клеток) Cytokine concentration, pg/mL (1 million cells)
	IL-17		IL-10
	спонтанная продукция spontaneous production	индуцированная продукция induced production	спонтанная продукция spontaneous production	индуцированная продукция induced production
9 (Б) 9 (B)	21,72	163,8	6,62	70,4
10 (А)	76,78	180,65	16,0	150,7

 

В образце крови здорового донора 10 (А) выявлено 68,8% CD3⁺Т-клеток, 43,7% CD3⁺CD4⁺ клеток, доля γδ TCR⁺ клеток составила 16,2%. Исходное содержание клеток с экспрессией γδ TCR составляло 1,3% (табл. 5). В супернатантах полученных клеточных культур концентрация IL-17 составила 76,78 пкг/мл, индуцированная ФГА продукция повысилась до 180,65 пкг/мл, спонтанная продукция IL-10 составила 16,0 пкг/мл, индуцированная повысилась до 150,70 пкг/мл (табл. 6).

Обсуждение

У пациентов с реактивными эритемами в процессе культивирования с золедронатом, IL-2 и IL-15 было получено к 7 дням культивирования от 3,1 до 62,8% γδ TCR⁺ клеток. В группе здоровых лиц к 7-му дню культивирования наблюдался рост содержания γδ TCR⁺ клеток до 16-24%. В большинстве культур отмечалось преобладание T-клеток (CD3⁺) и небольшая доля миелоидных клеток (1,3-8,7%), выполняющих функцию презентации антигена (фосфоантигенов) лимфоцитам.

В группе больных также наряду с исследованием содержания субпопуляций лимфоцитов крови на 7-й день культивирования и определением концентрации интерлейкинов IL-10 и IL-17 был проведен анализ клинических данных.

В группе больных многоформной эритемой было выявлено, что у пациентки 1 (С) после рецидива последовала длительная ремиссия. Возможно, высокие значения противовоспалительного IL-10 в данном образце указывают на благоприятный прогноз заболевания.

У пациентки 2 (Н) к 7-му дню культивирования МНПК в среде с добавлением цитокинов и золедроната накапливалось до 62,8% Т-клеток, несущих γδ-вариант Т-клеточного рецептора. Исследование проводилось в период тяжелого рецидива эритемы, отмечена большая длительность рецидива и последующая короткая ремиссия (1 месяц). Выявленная в данном случае высокая индуцированная продукция IL-17 и низкое содержание IL-10, вероятно, имеет прогностическое значение.

У пациентки 3 (С) при иммунофенотипировании культивируемых МНПК выявлено, что 23,6% клеток имело фенотип γδ TCR⁺. Исследование проводилось на фоне яркого затяжного рецидива (в этот период отмечена высокая индуцированная продукция IL-17), после которого последовала стойкая длительная ремиссия (более 6 месяцев). Выявленная в данном случае высокая способность к индуцированной продукции IL-10 (в результате индукции повысился в 7,7 раз), вероятно, имеет прогностическое значение.

У пациента 4 (С) в процессе культивирования с индукторами созревания количество γδ TCR⁺ клеток оставалось на низком уровне – 3,1%. У пациента наблюдалась МЭЭ с длительными затяжными частыми рецидивами (непрерывно-рецидивирующее течение) и ремиссиями не более 2 месяцев в году. Исследование проводилось в период рецидива легкой степени тяжести (в этот период выявлено низкое содержание IL-17).

У пациента 5 (К) процент накопленных к 7-му дню культивирования γδ TCR⁺ клеток был невысоким: 16,2%. У пациентов 4 (С) и 5 (К) наблюдались частые рецидивы на фоне длительного – месяцы – повышения температуры до 37,1 °С. Заболевание в обоих случаях связано с активностью вирусов (вируса простого герпеса и вируса Эпштейна–Барр).

У пациента 5 (К) отмечались длительные, но легкие по тяжести рецидивы (на фоне которых отмечена низкая продукция IL-17), заболевание имело непрерывно-рецидивирующее течение (сопровождается низкими уровнями продукции IL-10).

При анализе данных пациентки с кольцевидной эритемой получены следующие результаты. У пациентки 6 (Р) в процессе иммунофенотипирования клеточной суспензии, полученной в ходе культивирования клеток в ростовой среде с индукторами созревания было выявлено низкое число Т-клеток, экспрессирующих γδ TCR – 3,6%, что свидетельствует о том, что добавление индукторов созревания в виде комбинации золедроната, IL-2 и IL-15 в данном случае не оказало индуцирующего действия на пролиферацию γδ T-клеток. У пациентки в анамнезе отмечалась непрерывно-рецидивирующая форма КЦЭ, процесс характеризовался вялотекущим течением. Однако после данного рецидива последовала длительная стойкая ремиссия (в ходе исследования в конце рецидива отмечено повышение в 100 раз индуцированной продукции IL-10).

При анализе данных пациентов с ранней формой болезни Лайма – мигрирующей эритемой – в процессе культивирования было получено не менее 26,8% γδ TCR⁺ клеток. У пациентки 7 (С) отмечалась легкая форма мигрирующей эритемы (болезни Лайма). После проведенной терапии отмечался быстрый регресс высыпаний (выявлено повышение индуцированной продукции IL-10).

При анализе данных другой пациентки 8 (Д) с ранней формой болезни Лайма – мигрирующей эритемой – в процессе культивирования было получено не менее 44,5% γδ TCR⁺ клеток. У пациентки 8 (Д) спонтанная продукция провоспалительного IL-17 была на низком уровне, но в присутствии ФГА протекала интенсивно (усиление в 6,6 раз), также выявлены низкие значения спонтанной и индуцированной продукции противовоспалительного IL-10. При анализе клинических данных пациентки 8 (Д) было отмечено длительное существование и медленный регресс очага эритемы (в течение 4 месяцев после проведенной специфической терапии).

Заключение

Таким образом, в результате проведенного исследования было выявлено, что клеточный состав культивируемых МНПК, выделенных от больных реактивными эритемами и от здоровых лиц, имеет определенные различия: у больных отмечены более высокое содержание CD3⁺ лимфоцитов, γδ Т-клеток, активированных клеток СD3⁺HLADR⁺, а также клеток, экспрессирующих костимулирующую молекулу СD86, участвующую в активации Т-клеток. У пациентов с реактивными эритемами в процессе культивирования с золедронатом, IL-2 и IL-15 было получено к 7-му дню культивирования от 3,1% до 62,8% клеток с экспрессией γδ TCR.

В группе обследованных больных выявлены высокие уровни индуцированной продукции IL- 17, что может указывать на наличие аутоиммунного компонента в патогенезе заболевания или отражать тяжесть течения. Длительность ремиссии у обследованных больных коррелировала со способностью клеток крови в культуре in vitro к синтезу и высвобождению IL-10. Так, в группе исследованных больных было показано, что высокие значения спонтанной и индуцированной продукции IL-10 ассоциируются с длительной клинической ремиссией, в то время как при быстром наступлении нового рецидива выявлены низкие значения спонтанной и индуцированной продукции IL-10. Полученные данные указывают на вероятную прогностическую значимость IL-10 и IL-17 в роли биомаркеров у больных исследованными патологиями. Однако необходимы дальнейшие исследования в этом направлении, в том числе при других патологиях.

About the authors

Ekaterina V. Sorokina

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera; Academy of Postgraduate Education, Federal Research and Practical Center of Specialized Medical Care and Medical Technologies, Federal Medical-Biological Agency

Author for correspondence.
Email: sorokina-cathrine@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1188-6578
SPIN-code: 1052-6474

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Laboratory of Mechanisms of Regulation of Immunity, I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera; Professor, Department of Dermatovenerology and Cosmetology, Academy of Postgraduate Education, Federal Research and Practical Center of Specialized Medical Care and Medical Technologies, Federal Medical-Biological Agency

Russian Federation, Moscow; Moscow

Eugen O. Kalinichenko

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: gladius.domini@gmail.com

PhD (Medicine), Researcher, Laboratory of Mechanisms of Regulation of Immunity

Russian Federation, Moscow

Irina V. Bisheva

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: ibisheva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8143-7356
SPIN-code: 9846-1006

Researcher, Laboratory of Mechanisms of Regulation of Immunity

Russian Federation, Moscow

Vera N. Stolpnikova

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: stolpnikova@yandex.ru

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Mechanisms of Regulation of Immunity

Russian Federation, Moscow

Svetlana A. Skhodova

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: skhodova2009@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2342-9307

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Mechanisms of Regulation of Immunity

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files