Том 23, № 2 (2020)

Популяция CD4⁺Т-лимфоцитов является гетерогенной и объединяет клетки с различными функциями. На функциональную активность отдельных субпопуляций CD4⁺Т-лимфоцитов значительное влияние оказывает регуляция энергетического метаболизма клетки. В наивных CD4⁺Тлимфоцитах, CD4⁺Т-клетках центральной и эффекторной памяти, а также CD4⁺ терминальных эффекторах здоровых людей методом проточной цитофлуориметрии проведена оценка содержания транскрипционного коактиватора PGC-1α – регулятора окислительного фосфорилирования в клетке. Установлено, что PGC-1α экспрессируется во всех CD4⁺Т-лимфоцитах. Как среди конвенциональных, так и среди регуляторных клеток было обнаружено повышенное содержание PGC-1α в субпопуляциях CD4⁺Т-лимфоцитов центральной памяти, эффекторной памяти и терминальных эффекторах при их сравнении с наивными клетками. При этом содержание транскрипционного коактиватора в конвенциальных CD4⁺Т-клетках оказалось выше, чем в регуляторных CD4⁺Т-лимфоцитах. Полученные результаты свидетельствуют о том, что конвенциональные и регуляторные CD4⁺Т-клетки в разной степени зависят от присутствия транскрипционного коактиватора PGC-1α. По-видимому, PGC-1α является важным, но не единственным регулятором функционального состояния митохондрий регуляторных CD4⁺Т-лимфоцитов.

На экспериментальной модели термического ожога кожных покровов у лабораторных животных показано иммунотропное действие на факторы клеточного и гуморального иммунитета нового гелевого метабиотика, представляющий собой комплекс биологических активных веществ, продуцируемых штаммом ВКПМ Bacillus subtilis B-3679 в составе трех гелевых транскутанных основ: тизоля, эфтидерма и кремнийтитанорганического глицерогидрогеля. Цель исследования – оценка иммунотропной активности нового гелевого метабиотика на факторы клеточного и гуморального иммунитета при экспериментальном моделировании термических ожогов кожи. Экспериментальное исследование проведено на 60 белых лабораторных крысах линии Wistar, массой 180-220 г. Объектом исследования был метабиотик, представляющий собой комплекс биологически активных веществ, продуцируемых штаммом ВКПМ Bacillus subtilis B-3679 в составе трех гелевых транскутанных основ: тизоля, эфтидерма и кремнийтитанорганического глицерогидрогеля (КТГГ). В качестве контроля использовали зарегистрированную, стандартизированную противомикробную и ранозаживляющую мазь левосин. Полученные экспериментальные данные подтверждают эффективность использования исследуемых препаратов для лечения термических ожогов первой и второй степени, что выражается более быстрым уменьшением площади пораженного участка, по сравнению с подопытными животными, леченными левосином. При оценке терапевтической эффективности экспериментальных образцов гелевых препаратов на основе метабиотика изучали их влияние на различные факторы клеточного и гуморального иммунитета на модели термического ожога кожи. Исследовали такие показатели, как фагоцитарная активность нейтрофилов крови и перитонеальных макрофагов, количественное содержание Т- и В-лимфоцитов, антителобразующих клеток и иммуноглобулинов различных классов. Было установлено, что у экспериментальных животных с воспроизведенными моделями травматических повреждений кожи наблюдается повышение уровня всех изучаемых показателей гуморального иммунитета. В большей степени возрастала концентрация иммуноглобулина М, цирку лирующих иммунных комплексов и иммуноглобулина Е, а также исследуемых цитокинов. Увеличивался уровень α-интерферона и рецепторного антагониста интерлейкина-1.
Таким образом, исследование гуморального статуса у подопытных животных, получавших испытуемые гелевые препараты на основе метабиотика при моделировании термических ожогов кожи, позволяет сделать заключение об их существенном влиянии на различные звенья как клеточного, так и гуморального иммунитета.
Более выраженные эффекты отмечены для препаратов на основе метабиотика, содержащих тизоль и КТГГ.
В целом, на основании полученных экспериментальных данных, можно сделать вывод о сравнительно высокой терапевтической эффективности исследуемых препаратов при лечении термических ожоговых ран кожных покровов у подопытных животных. Применение этих препаратов обеспечивало более раннее отторжение некротических масс, ускорение процессов регенерации, предупреждало развитие вторичной раневой инфекции при ожогах.

Существенным достоинством лекарственных препаратов растительного происхождения является их слабая токсичность для человека и совокупное действие комплекса биологически активных веществ, преимущественно полисахаридов, флавоноидов и терпеноидов. Один из механизмов влияния лекарственных растений на процессы иммунорегуляции реализуется через воздействие на продукцию определенного спектра цитокинов. В работе проведено исследование иммунорегуляторной активности водных извлечений из лекарственного растительного сырья (ЛРС), содержащего полифенольные соединения – флавоноиды (рутин, кверцетин, называемые P-витаминами). Целью исследования явилась оценка профиля и уровня цитокинов, секретируемых мононуклеарами периферической крови человека под влиянием водных извлечений ЛРС, содержащих флавоноиды. Использованы водные извлечения ЛРС (1:10) следующих видов: листья смородины черной (Ribes nigrum L.), трава хвоща полевого (Equisetum arvense L.), трава тысячелистника обыкновенного (Achillea millefolium L.), корни солодки (Glycyrrhiza uralensis Fisch.), цветки бессмертника песчаного (Helichrysum arenarium (L.) Moench), листья земляники лесной (Fragaria vesca L.), плоды черемухи обыкновенной (Padus avium Mill.), цветки пижмы обыкновенной (Tanacetum vulgare L.) и трава овса посевного (Avena sativa L.), приобретенных через аптечную сеть. Продукция про- (TNFα, IL-8, IL-1β) и противовоспалительного (IL-10) цитокинов исследовалась с помощью ИФА («Цитокин», Россия) в супернатанте культуры мононуклеаров в присутствии ЛРС (опыт) и без добавления настоев (контроль). Количественное определение суммы флавоноидов в цветках и листьях проводили на основе реакции комплексообразования с алюминия хлоридом на спектрофотометре UV-3600 (Shimadzu, Япония). Установлено преимущественно ингибирующее влияние водных извлечений из ЛРС на уровень секреции как про- (TNFα, IL-8, IL-1β), так и противовоспалительного (IL-10) цитокинов. Выраженность супрессивного эффекта влияния водных извлечений из лекарственных растений на секрецию цитокинов составляла от 51,5±3,4 до 99,5±4,1% в сравнении с контрольным значением (р < 0,05). Установлено наличие прямой связи суммарного содержания флавоноидов в изученных пробах ЛРС с выраженностью их иммунорегуляторной активности по влиянию на секрецию цитокинов: для TNFα (r = 0,65), IL-8 (r = 0,4), IL-1β (r = 0,48) и IL-10 (r = 0,68). Результаты настоящего исследования позволяют заключить, что извлечения из изученного лекарственного растительного сырья могут рассматриваться как перспективные компоненты на этапе разработки препаратов, обладающих иммунорегуляторным и антифлогогенным эффектами.

В условиях воздействия ионизирующего излучения изучен антимутагенный эффект тритерпеноида милиацина для оценки его протекторных свойств при радиационной иммуносупрессии. Использованы мыши (CBAxC57Bl6)F1, разделенные на 4 группы: 1) интактные; 2) подвергнутые облучению; 3) подвернутые облучению после предварительного введения милиацина; 4) облученные после предварительного введения растворителя для милиацина. Облучение животных проведено на рентгеновской установке «РУСТ-М1» при дозе 4 Гр и экспозиции 288 с. Тест-системой служили миелокариоциты, анализ которых был проведен через 24 часа после облучения. Трехкратное предварительное введение милиацина в разовой дозе 4 мг/кг ослабляло мутагенный эффект облучения как по содержанию аберрантных клеток, так и по количеству аберраций на 100 метафазных пластинок. Вместе с тем эта протекция была существенно менее выраженной, чем при ранее установленной в условиях химического мутагенеза, что свидетельствует об ограниченных возможностях милиацина в защите центрального органа системы иммунитета – красного костного мозга при лучевом воздействии.

В работе приведены результаты исследования супернатантов суточных бульонных культур Staphylococcus aureus, продуцирующих и не продуцирующих цитокиноподобные вещества, имеющих различия по наличию генов белка А стафилококка, по определению неспецифической активности при проведении иммуноферментного анализа с применением наборов АО «Вектор-Бест» (Новосибирск), а также тест-систем ООО «ХЕМА» (Москва) для диагностики некоторых инфекций и уровня содержания гормонов. Установлено, что в супернатантах штаммов Staphylococcus aureus, продуцирующих цитокиноподобные вещества, тождественные человеческим, иммуноферментным методом было достоверно определено отсутствие неспецифической перекрестной активности у всех тест-систем, кроме HBsAg. Это может свидетельствовать о высокой специфичности остальных изученных тестсистем и косвенно подтверждает предположение о том, что стафилококки способны секретировать белки, специфически реагирующие в основном с антителами против цитокинов человека, а также могут давать перекрестные реакции с другими антигенами, но не с антителами. Цитокиноподобная или неспецифическая активность не зависит от наличия или отсутствия белка А у изученных штаммов стафилококков.

Наряду с функционированием в ткани нервной системы эндогенные опиоидные пептиды – агонисты мю-, дельта- и каппа-опиоидных рецепторов – оказывают разнообразное регулирующее влияние на клетки иммунной системы. Кроме того, существуют экспериментальные доказательства того, что экзогенный агонист мю-опиоидных рецепторов – морфин – оказывает влияние на жизнеспособность клеток иммунной системы. Данные эффекты обнаружены в экспериментах как с клеточными культурами, так и на лабораторных животных. Поэтому мы исследовали влияние эндогенных опиатов – динорфина А и бета-эндорфина – на жизнеспособность мононуклеаров периферической крови человека. В наших экспериментах была использована периферическая венозная кровь 14 условно здоровых добровольцев, каждый из которых перед забором биоматериала подписывал информированное согласие и имел возможность задать все интересующие его вопросы. Мононуклеарные клетки получали из гепаринизированной венозной крови методом разделения на градиенте плотности по стандартной методике. Для оценки пролиферации мононуклеары культивировали во влажной атмосфере в течение 72 часов. За 18 часов до окончания культивирования в каждую лунку вносили по 2 мкКи ³H-метилтимидина. Радиоактивность проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике “Guardian” (Wallac, Финляндия) и выражали в имп/мин. Для оценки развития апоптоза клетки культивировали в течение суток в тех же условиях, за исключением добавления радиоактивной метки. Затем клетки окрашивали с помощью реагентов Annexin V-FITC/7-AAD kit (Beckman Coulter, США) согласно инструкции производителя и регистрировали апоптоз лимфоцитов методом проточной цитометрии. Исследование апоптоза клеток проводили на проточных цитофлюориметрах BD FACSCalibur (Becton Dickinson, США) или CytoFLEX S (Beckman Coulter, США). Гейт лимфоцитов (гейтировали по параметрам прямого и бокового светорассеяния) отображали на гистограмме Annexin V-FITC/7-AAD и подсчитывали долю (в процентах) живых клеток, связывающих аннексин (Annexin V-FITC⁺/7-AAD-). Статистическую обработку результатов проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента. Было установлено, что агонисты мю- и каппа-опиоидных рецепторов бета-эндорфин и динорфин соответственно в физиологических концентрациях (10^-10М и 10^-8М) оказывают разнонаправленное влияние на пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови человека. Так, динорфин А стимулирует спонтанную пролиферацию и пролиферацию, вызванную субоптимальным воздействием митогена. Бета-эндорфин усиливает эффект субоптимальной концентрации митогена и значительно угнетает пролиферацию при максимальной активации клеток. Модулирующие эффекты бета-эндорфина и динорфина А in vitro на пролиферацию не связаны с усилением гибели клеток путем апоптоза.

Регуляторный ревматоидный фактор (регРФ) представляет собой отдельную популяцию ревматоидного фактора, имеющую потенциал использования в клинической диагностике, а лимфоциты, его продуцирующие, – перспективная терапевтическая биомишень при аутоиммунных заболеваниях. Поэтому важно знать условия его надежного выявления у человека и лабораторных животных. Для выявления регуляторного ревматоидного фактора был использован метод агглютинации танизированных IgGнагруженных эритроцитов, так как данный метод выявляет только регуляторный ревматоидный фактор, в отличие от метода латекс фиксации, который выявляет и регуляторный ревматоидный фактор и классический ревматоидный фактор, ассоциированный с ревматическими заболеваниями. Обнаружено, что для определения уровня регРФ у крыс следует использовать свежую или замороженная сыворотку. В свежеполученной плазме крови крыс, стабилизированной гепарином, цитратом натрия или ЭДТА, регРФ не выявляется, что возможно связано с присутствием фибриногена, имеющего, как известно, сродство к IgG. Гепарин также самостоятельно затрудняет выявление регРФ у крыс. У человека регРФ надежно выявляется в плазме крови, стабилизированной цитратом натрия, предварительно замороженной. При использовании сыворотки крови для выявления регРФ у человека в небольшом количестве случаев были получены ложно-отрицательные результаты.

Цель исследования – оценка патогенетической значимости мутаций гена TP53 у взрослых больных острыми миелоидными лейкозами (ОМЛ). Клиническое наблюдение проведено на 114 пациентах с ОМЛ на базе Свердловской областной клинической больницы № 1 (г. Екатеринбург), из них 56 – мужчины, 58 – женщины. Средний возраст обследованных составлял 53,3±2,8 лет.
Морфологически диагноз «ОМЛ» во всех случаях был предварительно верифицирован в специализированных лабораториях с использованием стандартных цитологических, цитохимических, иммунофенотипических, гистологических и иммуногистохимических методик. В исследование были включены следующие варианты ОМЛ: М0 – 5, М1 – 9, М2 – 47, М2базо – 3, М2эо – 2, М3 – 8, М4 – 25, М4эо – 3, М5 – 3, М6 – 4, М7 – 1, острый миелофиброз – 1, бластная плазмацитоидная дендритоклеточная опухоль – 2. Исследовали пробы периферической крови и аспиратов костного мозга пациентов. Все образцы протестированы на наличие молекулярных повреждений экзонов 4-11 гена ТР53. Кроме того, 81 проба, в том числе 22 – ОМЛ с нормальным кариотипом и 23 – с неуточненным, были обследованы на наличие мутаций гена NPM1 молекулярно-генетическим и иммуногистохимическим методами. Секвенирование кДНК осуществлялось на автоматическом генетическом анализаторе по прямой и обратной последовательностям. Обработка результатов секвенирования осуществлялась с использованием программы MEGA Х на основе статистической гипотезы, что они могут быть описаны биномиальным распределением. Проверка статистической гипотезы проведена с использованием точного критерия Фишера и χ².
По результатам цитогенетического и ПЦР-исследований благоприятный прогноз определялся в 25 наблюдениях (21,9%), промежуточный – в 24 (21,1%), неблагоприятный – 33 случая (28,9%). В 32 пробах (28,1%) методами стандартной цитогенетики и ПЦР в реальном времени выявить генетические аномалии не удалось, соответственно, вариант прогноза у таких больных оказался не уточнен.
Миссенс-мутации ТР53 были представлены транзициями C292T, A377G, A659G, C817T (4 случая) и трансверсиями C569G, G733T, G841C (3 случая), также определялись синонимичные замены A639G (1,8%) и C891T (0,9%) по третьей позиции кодона, не имевшие патогенетического значения. В одной пробе (0,9%) определялась делеция тимидина в позиции 645 кодирующей последовательности, приводящая к синтезу укороченного мутантного белка. Все вышеуказанные мутации локализовались в области ДНК-связывающего домена. Также в одном наблюдении (0,9%) выявлена тандемная дупликация протяженностью 19 оснований в 960 позиции кодирующей последовательности NLS-домена белка, располагающаяся на сайте ацетилирования. Несинонимичная трансверсия C215G, являвшаяся полиморфным вариантом гена, определялась в 94 пробах (82,5%). Клинически все TP53-позитивные ОМЛ характеризовались неблагоприятным прогнозом и первичной резистентностью опухоли к стандартной полихимиотерапии. Средний возраст таких больных составил 63,0±5,4 лет, что достоверно выше, чем в среднем по выборке. Средняя длительность наблюдения равнялась 3,1±0,9 месяца.

В последние десятилетия частота и распространенность аллергической патологии среди детского населения значительно увеличились. Цель исследования – изучить особенности специфической сенсибилизации к гаптенами и иммунный статус у школьников различных возрастных групп, в условиях высокой напряженности образовательного процесса. Перечень показателей специфической сенсибилизации к металлам и органическим соединениям изучен: у 67 детей первых классов и 35 детей 6-7 классов, обучающихся в школе с высокой напряженностью образовательного процесса и одновременно в условиях хронического воздействия экзогенных химических гаптенов (группа наблюдения № 1 и группа наблюдения № 2 соответственно); у 20 учеников начальных классов и 27 учеников 6-7 классов, обучающихся в условиях отсутствия избыточного воздействия негативных факторов (группа сравнения № 1 и группа сравнения № 2 соответственно). Определение иммуноглобулинов IgE специфического к марганцу, IgE специфического к никелю, IgE специфического к формальдегиду и IgG специфического к бензолу, IgG специфического к свинцу, IgG специфического к фенолу выполнено с использованием методологии аллергосорбентного тестирования; определение IL-4 (Th2) – методом иммуноферментного анализа; оценка уровня экспрессии CD19⁺ -рецептора на лимфоцитах – методом проточной цитометрии. В работе использовался простой линейный регрессионный анализ. Для проверки нулевых гипотез о равенстве средних значений между двумя независимыми группами с нормальным распределением применялся двухвыборочный критерий Стьюдента.
Установлено, у школьников, обучающихся в условиях хронического поступления экзогенных гаптенов, степень специфической сенсибилизации меняется с возрастом. У обучающихся старших классов относительно учеников начальных классов значительно возрастает уровень специфической сенсибилизации к органическим соединениям (уровень IgG к фенолу – в 1,5 раза) с одновременным существенным ростом экспрессии Th2 цитокинов (IL-4 – в 1,8 раза) и активацией гуморального звена иммунитета (повышение процентного содержания CD19⁺ лимфоцитов – в 1,3 раза). Установлена вероятностная причинно-следственная связь между содержанием в крови экзогенного гаптена фенола и повышением концентрации IgG специфического к фенолу (F = 140,81; R² = 0,53; p < 0,001). Особенностями специфической сенсибилизации к гаптенам у обучающихся в динамике образовательного процесса является прогрессивный рост ее уровня, ассоциированный с возрастом обучающихся или временем гаптенной экспозиции.

Радиационно-индуцированные изменения со стороны иммунной системы развиваются достаточно рано после начала радиационного воздействия и сохраняются спустя длительное время после прекращения облучения. При хроническом радиационном воздействии с мощностью дозы меньше 0,1 Гр/год порог годовой дозы облучения красного костного мозга для угнетения иммуногемопоэза составляет 0,3-0,5 Гр. Показано, что при хроническом действии ионизирующего излучения в кроветворной системе запускаются адаптационные механизмы. В данной работе количественно и качественно охарактеризованы взаимосвязи между отдельными звеньями врожденного и адаптивного иммунитета, что важно для понимания особенностей гомеостаза и адаптационных возможностей иммунной системы у хронически облученных лиц в отдаленные сроки. В основную группу было включено 376 жителей населенных пунктов, расположенных в бассейне реки Течи, загрязненной радиоактивными отходами в 1949-1960 гг. Средняя величина дозы облучения красного костного мозга у них составляла 1,08±0,04 Гр (диапазон доз был широким: 0,08-4,46 Гр), возраст варьировал в диапазоне от 58 до 88 лет (среднее значение – 70,3±0,3 года). Группа сравнения была представлена 162 необлученными людьми, возраст которых колебался в пределах от 58 до 90 лет (среднее значение – 69,3±0,5 лет). Методом корреляционного анализа по Кендаллу в основной группе выявлено 82 статистически значимые корреляции (коэффициент корреляции более 0,3, p – менее 0,05) между отдельными показателями иммунитета относительно 65 аналогичных корреляций в группе сравнения. Для большинства выявленных взаимосвязей в обеих группах коэффициент корреляции составил от 0,3 до 0,5 (57 связей – в основной группе, 41 – в группе сравнения), корреляций с коэффициентом от 0,5 до 0,7 насчитывалось 16 в основной группе и 14 – в группе сравнения, в то же время значение коэффициента корреляции свыше 0,7 было отмечено для 9 взаимосвязей в основной группе и для 10 – в группе сравнения. Анализ методом χ-квадрат не позволил отметить статистически значимых различий в общем количестве корреляций и количестве корреляций разной силы в сравниваемых группах. Полученные результаты согласуются с результатами ранее проведенных исследований и подтверждают, что изменения в иммунной системе у людей, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию, в отдаленные сроки носят невыраженный характер и свидетельствуют о наличии у них компенсаторных механизмов регуляции по принципу прямой и обратной связи.